使用目的:本金魚相關(guān)蛋白AGRP試劑盒用于測定金魚血清、血漿及相關(guān)液體樣本中Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP)含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中金魚相關(guān)蛋白AGRP水平。用純化的金魚Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP),再與HRP 標記的Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中金魚Agouti 相關(guān)蛋白(AGRP)濃度。
金魚相關(guān)蛋白AGRP試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶
2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品(80ng/L) 0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張
6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個
標本要求
1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融
2.不能檢測含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋:本金魚相關(guān)蛋白AGRP試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
40 ng/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
20 ng/L 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
10 ng/L 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
5.0 ng/L 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2.5 ng/L 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液:將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此重復5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:金魚相關(guān)蛋白AGRP每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10 分鐘.
10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11.測定:以空白空調(diào)零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結(jié):
計算
以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式,樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。