根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液,把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁,使兩類細胞相互分離,操作方法與傳代相同。
(1)待細胞生長達一定數(shù)量后,倒出舊培養(yǎng)液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養(yǎng)液,吹打制成細胞懸液;
(2)取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5~20分鐘后,輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)基液,再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);
(3)培養(yǎng)B瓶中細胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補加*培養(yǎng)基。
當三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)基液后,均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,B瓶兩類細胞相雜,C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,直至癌細胞純化為止。
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:
(1)標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;
(2)刮除:棄掉培養(yǎng)液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間;
(3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞;
(4)注入培養(yǎng)基液繼續(xù)培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除至*除掉為止。