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胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展
更新時間:2012-05-02   點擊次數(shù):4734次

胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

摘要:本文就胃蛋白酶的生物提取法,對其在過程中的分離、純化技術(shù)展開綜述。其中,分離技術(shù)主要介紹了:鹽析法、有機溶劑沉淀法、底物親和法、透析法。純化技術(shù)主要介紹了:凝膠過濾法、透析離子交換法。綜合比較各分離純化方法的特點,得到*的分離純化方法有機溶劑與鹽析共沉淀法、膜分離技術(shù)、等電點沉淀法與底物親和法。

關(guān)鍵詞:胃蛋白酶 分離 純化  應(yīng)用 

生物提取法胃蛋白酶

 

1工藝路線 

          (自溶、過濾)       (脫脂、去雜質(zhì))

 

豬胃黏膜自溶液上清液

 

(濃縮、干燥)

 

胃蛋白酶成品

 

1.2工藝過程

 

1)原材料的選擇和預(yù)處理:胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部,采集原料時剝?nèi)〉恼衬ぶ睆酱笮∨c收率有關(guān)。一般取直徑10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜zui適宜,每頭豬胃平均剝?nèi)≌衬?/font>100g左右。(2)自溶、過濾:在夾套鍋內(nèi)預(yù)先加水100升及鹽酸3.6-4升,加熱至50度時,在攪拌下加入200千克豬胃黏膜,快速攪拌使酸度均勻,保持45—48度,消化3-4小時,得自溶液。用紗布過濾除去未消化的組織尿蛋白,收集濾液。(3)脫脂、去雜質(zhì):將濾液降溫至30℃以下,加入15-20%氯仿或乙醚,攪勻后轉(zhuǎn)入沉淀脫脂器內(nèi),靜置24-48小時,使雜質(zhì)沉淀,分出棄去,得脫脂酶液。(4)濃縮、干燥:取清酶液,在40℃以下減壓濃縮至原體積的14左右,再將濃縮液真空干燥。球磨過80-100目篩,即得胃蛋白酶粉。

 

2胃蛋白酶的分離技術(shù)

 

2.1有機溶劑法

 

可用于胃蛋白酶的初步提取濃縮。通常使用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮,其沉淀蛋白質(zhì)的能力為:丙酮>異丙酮>乙醇>甲醇。當(dāng)然此順序也不是一成不變的,因為還要受溫度、pH、離子強度等因素的影響。丙酮沉淀能力,但揮發(fā)損失多,價格較昂貴,所以工業(yè)上常采用乙醇作為沉淀劑。

 

胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

22鹽析法

 

鹽析法是酶制劑工業(yè)中常用方法之一,硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉是常用的鹽析劑,其中用的zui多的是硫酸銨。美國(2701,228)改進(jìn)后,用鋅鹽沉淀胃酶。當(dāng)母液含醇(或酮)在50%--55%pH5.0—5.2時幾乎全部胃酶可以用醋酸鋅沉淀,沉淀物為胃酶的鋅鹽,然后用金屬螯合劑除去鋅鹽,得15000—16000倍活力的酶,收集率為5.0%--5.5%。此法較上述有機溶劑沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

 

2.3底物親和法

 

底物親和法是利用酶(胃蛋白酶)與其底物(酪蛋白)的親和性,從胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸緩沖液中充分結(jié)合,然后調(diào)pH4(底物的等電點)沉淀底物和酶的結(jié)合物,隨后讓沉淀物再溶解于乳酸緩沖液中,添加低濃度的SDS將底物和酶分離,得到酶—SDS復(fù)合物,再進(jìn)一步分離純化。陳躬瑞(2001)成功的應(yīng)用此法對蛇胃蛋白酶進(jìn)行了實驗室分離,得率大約為30%。與傳統(tǒng)的分離方法比較,此法具有簡單的優(yōu)點,為后續(xù)的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用,同時具有較高的特異性。【2

 

2.4透析法

 

胃蛋白酶的分離過程中還經(jīng)常用到透析法。該法是利用蛋白質(zhì)大分子對半透膜的不可透過性而與小分子物質(zhì)及鹽分開的。由于透析主要是擴散過程,如果袋內(nèi)外的鹽濃度相等,擴散就會停止,因此要經(jīng)常換溶劑,一般一天換2—3次。如在冷處透析,則溶劑也要預(yù)先冷卻,避免樣品變性。透析時的鹽是否除凈,可用化學(xué)試劑或電導(dǎo)儀來檢測?!?/font>1

 

3胃蛋白酶的純化技術(shù)

 

3.1凝膠過濾法

 

美國在20世紀(jì)60年代研究結(jié)晶為蛋白酶的 工藝時,是將75mg的胃蛋白酶原樣本溶解在8mL的蒸餾水中(pH5060),在14℃±1。,pH20下,保持20min激活。然后用磺乙基Spandex G-25層析,zui后用羥基磷灰石進(jìn)行色譜層析。結(jié)果表明用層析法得到的胃蛋白酶為單一物質(zhì)純品。

 

3.2離子交換層析法

 

陳躬瑞等人在純化蘄蛇胃蛋白酶時將SDS沉淀后的上清液上樣到預(yù)先用005molL乙酸緩沖液(pH50)平衡的DEAE—TOYOPEARL離子交換色譜柱(46mm X 100mm)上,用0O25mo1L氯化鈉梯度洗脫,流速為1mlmin。得到的酶在5O℃30min有較高的活性,有望應(yīng)用于高溫食品加工中 ?!?/font>2

 

基于以上對胃蛋白酶的分離純化技術(shù)的比較分析可以看出,長期以來分離提取技術(shù)一直沒有取得較大的突破,用有機溶劑、鹽析等技術(shù)得到的天然胃蛋白酶產(chǎn)品,純度、生物活性愈將不能滿足醫(yī)藥品和工業(yè)日益增長的需要。隨著分離科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,采用新型分離技術(shù)分離胃蛋白酶已勢在必行。因此,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為以下幾種技術(shù)是胃蛋白酶分離純化的方向。

 

胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

3.21有機溶劑與鹽析共沉淀

 

有機溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳統(tǒng)方法,有其各自的特點。如果將有機溶劑和鹽析配合使用,不僅可以降低鹽的用量,而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來的問題,得到的胃蛋白酶純度和活性也會有所增加。

 

3.2.2膜分離技術(shù)

 

分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過功能的薄層物質(zhì),能利用分子大小實現(xiàn)分離,從而起到濃縮和分離純化的作用。由于其可在維持原生物體系環(huán)境的條件下實現(xiàn)分離,并可地濃縮、富集產(chǎn)物,有效地去除雜質(zhì),加之操作簡單,結(jié)構(gòu)緊湊、能耗低,過程簡化,無一次污染,也將成為胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。

 

3.2.3等電點沉淀法與底物親和法

 

胃蛋白酶具有極低的等電點如豬胃蛋白pH10),但胃蛋白酶的分離純化技術(shù)中等電點沉淀法未見報道,如果此方法可實現(xiàn),那將大大縮短分離純化的時間。底物親和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點,但其工藝條件還不成熟,尤其是在分離底物和酶的復(fù)合物時,SDS的添加量有待研究。

 

結(jié)論

 

有人預(yù)言,21世紀(jì)將是生物技術(shù)的世紀(jì),尤其是生物制藥技術(shù)的世紀(jì)。生物制藥被譽為21世紀(jì)的朝陽產(chǎn)業(yè)。得益于生物制藥技術(shù)的酶類藥物也日趨成熟。的胃蛋白酶分離純化工藝、技術(shù)和設(shè)備的出現(xiàn),人們必將開發(fā)出的胃蛋白酶提取工藝。這對于提高功能性胃蛋白酶產(chǎn)品、提高率、降低成本和改善人民生活水平起著舉足輕重的作用。而胃蛋白酶單一組分的制備分離,可為胃蛋白酶的研究開發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)品,同時能為后期胃蛋白酶單一組分生理活性的研究提供必要的物質(zhì)保障。

 

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