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細(xì)胞培養(yǎng)方法
更新時(shí)間:2011-12-09   點(diǎn)擊次數(shù):1596次

細(xì)胞培養(yǎng)方法
一、準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備工作對(duì)開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應(yīng)給予足夠的重視,推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無(wú)法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試,具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
二、取材
在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞(視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過(guò)一定的處理(如消化分散細(xì)胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中,這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng),實(shí)際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織與分化高相比之下,分化程度低的組織的容易培養(yǎng),腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理,盡快培養(yǎng),因故不能馬上培養(yǎng)時(shí),可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌,同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細(xì)胞的方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱(chēng)為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng),則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部,再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng),一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按要求以一定的量(以每毫升細(xì)胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后,立即放入培養(yǎng)箱中,使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀(guān)察一次,觀(guān)察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好,形態(tài)是否正常,有無(wú)污染,培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對(duì)培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。一般原代培養(yǎng)進(jìn)入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等),在潛伏期細(xì)胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過(guò)了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長(zhǎng)期。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng),將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱(chēng)為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代,而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無(wú)限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì),也可能僅有不死性(Immortality)而無(wú)惡性。培養(yǎng)正在生長(zhǎng)中的細(xì)胞是進(jìn)行各種生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好材料。
四、凍存及復(fù)蘇
為了保存細(xì)胞,特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株,要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—-196℃,將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以一定的冷卻速度凍存,zui終保存于液氮中。在極低的溫度下,細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。復(fù)蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。

 

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